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    PRM靶向蛋白組相對定量

    PRM靶向蛋白組相對定量

    • 所屬分類:定性/定量蛋白質組學
    • 瀏覽次數:
    • 發布日期:2020-12-17 17:09:49
    • 產品概述
    • 案例解析

    靶向蛋白質組技術,顧名思義是只選取和檢測目標蛋白相關的信號,忽略其他無關的信號,因此可以實現對目標蛋白定量的高特異性和高準確性。PRM是Labelfree 、iTRAQ/TMT等組學技術的好伙伴。大規模組學技術不可避免地存在定量假陽性的問題,組學結果往往需要采用特異性的檢測方法來驗證。目前最常規的方法如蛋白水平WB、ELISA,而PRM在后續靶蛋白驗證方面具有獨特的優勢:不依賴抗體,可選擇性、特 異性地對目標蛋白質進行定性定量分析(或定量分析)。

    PRM(平行反應監測,Parallel Reaction Monitoring)是一種基于高分辨、高精度質譜的靶向蛋白質組學技術,能夠對目標蛋白質、目標肽段有針對性的選擇數據進行質譜數據采集,對于符合目標離子規則的信號進行采集,去除不符合規則的離子信號的干擾。從而實現對目標蛋白質/肽段進行定性定量。


    技術原理

    PRM是相對于傳統SRM/MRM建立起來的高分辨率離子監測技術。PRM基于Q. Orbitrap為代表的四級杄-高分辨質譜平臺,與SRM每次掃描一個Transition不同,PRM每次對一個母離子生的所有Transition進行全掃描,即平行監測了一個母離子對應的所有離子對。PRM質譜分析經過三個階段:1,通過MS篩選岀與目標分子特異性一致的母離子;2,碰撞碎裂這些母離子,去其他離子的干擾;3.只對選定的特異MS/MS2離子進行質譜信號的采集。PRM質譜技術是高精準度的蛋白定量鑒定技術,是一次性精準定量硏究復雜樣品中多個目標蛋白的絕佳方法。如果借助同位素標記的目標肽段作為內參,可以實現蛋白定量鑒定。


    PRM技術流程圖


    技術優勢

    1.高分辨離子監測,質量精度達ppm級,在不損失靈敏度的情況下,大程度排除了背景干擾;

    2.MS2為全掃描,無需事先確定離子對和優化碰撞能量,只需要在數據處理時選擇響應較高的一個或幾個離子即可提取母離子對的色譜峰進行定量,線性范圍可達5-6個數量級;

    3.同時定性與定量分析,二級全掃描譜圖用于定性分析,選擇其中優質的子離子提取離子對即可完成定量分析。


    與傳統WB/ELISA相比有獨特優勢


    應用領域

    生物標志物驗證 驗證蛋白翻譯后修飾 驗證低豐度蛋白


    PRM靶向蛋白組學案例解析


    KIF5A依賴性軸突轉運缺陷對三甲基氯化錫誘導的神經毒性中自噬通量的影響

    KIF5A-dependent axonal transport deficiency disrupts autophagic flux in trimethyltin chloride-induced neurotoxicity


    研究對象:Neuro-2a細胞         期刊:Autophagy

    影響因子:10.1080                  發表單位:第三軍醫大學



    背景介紹

    三甲基氯化錫在工業和農業領域中廣泛用作殺菌劑和塑料穩定劑的組成成分,普遍被認為具有有效的神經毒性,尤其是在海馬中。然而,三甲基氯化錫誘導神經毒性的機制仍然不清楚。該研究通過蛋白質組學分析揭示了巨自噬/自噬溶酶體機制在三甲基氯化錫誘導的神經毒性中的重要作用,并確定了三甲基氯化錫受損自噬通量的關鍵靶標KIF5A。

    樣本策略:三甲基氯化錫處理后的Neuro-2a細胞技術策略:TMT標記定量


    結果速遞

    1.通過細胞增殖實驗以及Western Blo、熒光共定位實驗證明TMT可以抑制細胞自噬及增殖。


    2.對細胞樣本的蛋白質組學分析中, 與對照組相比, 三甲基氯化錫組中共有 340種差異蛋白,其中204種蛋白上調,136種蛋白下調。通過對差異蛋白進行KEGG與IPA分析發現,自噬在三甲基氯化錫誘導的神經毒性中起到重要作用,且研究結果證明了三甲基氯化錫在Neuro-2a細胞中是一種有效的自噬抑制劑。


    3.對蛋白質組學結果進一步分析, 發現參與調節Neuro-2a細胞中三甲基氯化錫損傷自噬通量的關鍵靶標蛋白KIF5A。進一步自噬通量表型研究發現KIF5A過表達可防止三甲基氯化錫誘導的神經毒性和自噬通量受損。使用基于

    PRM的靶向蛋白質組學技術對KIF5A過表達進行靶向驗證, 研究發現三甲基氯化錫誘導的蛋白表達趨勢同樣可以得到逆轉。該研究將有助于理解軸突運輸和自噬在環境應激引起的神經系統疾病發展中的作用。


    Neuro-2a細胞暴露于TMT,通過蛋白質組分析其神經毒性的潛在靶標。發現自噬相關蛋白質在TMT作用后表達水平顯著改變,表明自噬參與TMT誘導神經毒性這一過程。為探究TMT破壞Neuro-2a細胞內自噬流的分子機制,通過IPA分析分子作用網絡,提示KIF5A很可能是TMT破壞自噬流的關鍵因子。進一步通過在體實驗探究KIF5A在TMT破壞自噬流過程中的作用。在小鼠腹腔內注射TMT后,發現小鼠產生癲癇現象, 小鼠海馬體大量神經元缺失, 溶酶體蛋白酶活性受損。最后, 通過小鼠的尾靜脈注射AAV PHP.eB-Kif5a過表達KIF5A,發現自噬流紊亂恢復并逆轉TMT誘導的神經毒性。



    參考文獻

    Liu M, Pi H, Xi Y, et al. KIF5A-dependent axonal transport deficiency disrupts autophagic flux in trimethyltin chloride-induced neurotoxicity[J]. Autophagy, 2020, 1 -22. IF 11. 059

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