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    「青蓮聚焦」外泌體新型分離武器震撼登場

    2021-04-30 00:00:00

    想要研究外泌體,首先分離外泌體是必不可少的步驟,外泌體因其特殊結構,在分離純化方面面臨很多挑戰。目前最為廣泛外泌體分離常用的方法是超速離心法,根據細胞、細胞碎片、外泌體的密度和大小不同進行分離,耗時長,多達8-10個小時;免疫親和方法根據外泌體的特異性進行分離,如CD63, CD81, CD9。同樣存在加工時間長(4-20 h)、重現性差等缺點;尺寸排阻法根據外泌體和蛋白溶液粒徑大小不同進行分離,這種方法更利于大量外泌體制備,但是由于外泌體濃度較低,不利于后面科研實驗研究。

    在這種情況下,迫切需要新的外泌體分離方法,能夠快速有效地分離出純度高的外泌體,因此,我們引進了新型的富集材料TiO2,一種能特異性結合磷脂雙分子層囊狀結構的新型武器

    新型分離武器的正確打開方式



    液體上樣首先使用0.22微米的濾膜過濾,去除細胞碎片和較大細胞外囊泡,然后與TiO2孵育,清洗3次,最后將外泌體洗脫下來,進行后續實驗(電鏡、NTA、WB、蛋白組學質譜檢測等等)。



    新型分離武器技能描述

    1.電鏡確證

    掃描電鏡觀察到的TiO2是粒徑5微米的球,表面是干凈光滑的,與樣本孵育之后清洗雜質之后,球表面附著了無數的100nm粒徑的小囊結構。經過透射電鏡觀察確證這些富集到的顆粒有典型的cup-shaped 結構。






    2.免疫確證

    使用外泌體表面特異性的抗體,如TSG101、CD81對富集前后TiO2進行免疫熒光實驗。如圖所示,在TiO2微球的表面觀察到較強的熒光信號,在對照組樣本中只有很小的熒光。證明TiO2富集到了外泌體并且只有結構完整的外泌體才能被富集。





    3.NTA電鏡確證

    從TiO2上洗脫下來的外泌體經過了透射電鏡和NTA分析,在洗脫液中典型的杯狀結構依然完整,表明在分離和洗脫過程中,磷脂雙分子層結構依然保留。
    NTA分析結果顯示TiO2分離的外泌體大小分布在65 ~ 235 nm之間,中心位于133nm。





    新型分離武器華山論劍

    1.鑒定數量比較

    超速離心法和外泌體試劑盒法是市面上常用的外泌體分離方法,將TiO2分離法與其他兩種方法進行了多角度的比較。對使用三種方法分離出來的外泌體進行了質譜鑒定,分析發現TiO2法鑒定384個蛋白,遠高于其他兩種方法(超離228個蛋白,試劑盒252個蛋白),與超離相比,提升了40%的蛋白鑒定率。三種富集方式分別鑒定到外泌體蛋白為307(TiO2), 171 (超速離心)和 187(試劑盒法),TiO2法獨有的190個蛋白中有144個蛋白是ExoCarta 外泌體數據庫中報道過的外泌體蛋白,127個蛋白定位在外泌體,進一步證明TiO2分離外泌體的可靠性。





    2.蛋白富集比較

    對鑒定到的蛋白進行GO分析和DAVID功能聚類分析發現,TiO2鑒定到的蛋白中,外泌體蛋白的富集度,這表明TiO2富集的外泌體純度高。



    3.常見污染蛋白比較

    挑選了18種典型的外泌體標記物,它們是外泌體中常見的前100種蛋白質(ExoCarta)。以超離心得到的相應蛋白量為參考,歸一化后,得到18個外泌體標記物數量的對數倍差值。

    TiO2法和試劑盒法提取的大多數外泌體標記物的數量明顯較高(對數值為正),血清中的污染物,即白蛋白(ALB)、IgG (IGHG1-IGHG4)、IgA (IGHA1和IGHA2)、觸珠蛋白(HP)和轉鐵蛋白(TF),在TiO2富集樣品中的含量明顯低于試劑盒法和超離樣品(圖中為負對數值)




    4.回收率和實驗時間比較

    評估了從血清樣本中分離外泌體所需的回收率和分析時間,包括超速離心、密度梯度離心、粒徑排阻層析,超速離心,免疫親和法以及聚合物沉淀法。外泌體回收率在5分鐘內達到80%,與已發表的其他方法相比,TiO2法是最有效的血清外泌體分離方法。


    結論


    綜上所述,基于外泌體與TiO2的特異性相互作用的新型分離武器,具有回收率高,重現性好、污染少的優點,它能洗脫分離出完整外泌體結構,也可以直接裂解用于下游蛋白質組分析,與傳統的方法相比,基于TiO2的外泌體分離方法是一種簡單、快速、高效的血清外泌體研究方法。



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