1.高通量尿液蛋白組前處理體系的建立

尿液是良好的生物標志物來源，與血液相比，尿液的采集無創，有利于連續采集進行監控，并且成分相對簡單，高豐度蛋白較血液中少，對于蛋白質組研究更加有利。研究者通過改進濾膜輔助酶切（FASP）方法，建立了高效的尿液蛋白前處理方法，可在15小時內進行進行多達48個尿液樣品的蛋白提取和酶切。通過質譜鑒定，在116個尿液樣品中共鑒定得到2688個蛋白，平均每個尿液樣品得到918個蛋白。質控樣品的鑒定表明，體系也較穩定。因此，此方法可為尿液蛋白質組研究提供高通量的前處理體系參考。

圖1 高通量尿液蛋白質組學處理體系的流程，及HCC及高危人群組尿液樣本鑒定情況

2.尿液蛋白標志物的篩選

研究者對HCC血清標志物AFP以及尿液GPC3和GP73進行了診斷效果的評價，發現這三個蛋白在進行HCC與高危人群診斷時，分類效果不佳。因此研究者根據產出的尿液蛋白質組數據，利用機器學習的方法進行新的HCC標志物的發現。在由43個高危人群和36個HCC尿液樣品組成的訓練集中，利用特征選擇的算法進行蛋白質的排序。通過計算權重和約登指數，最終選擇AUC和約登指數均較好的七個蛋白（HPX，APOH，APCS，PLG，GOT1，GLRX，NCR3LG1）作為HCC標志物進行分析。

圖2 訓練集中尿液標志物數量的評價和權重排序

3.尿液蛋白聯合模型的建立

研究者利用篩選得到的7個蛋白，進行了不同算法聯合模型的評價，包括隨機森林模型和投票模型。在訓練集中，通過十倍交叉驗證分析，評價兩種模型的AUC，靈敏度和特異度，并在由19個高危人群和18個HCC尿液樣品組成的驗證集中進一步驗證聯合模型的分類效果，最終發現投票模型的診斷效果強于隨機森林模型，并且投票模型的算法結構簡單，在臨床上應用的可行性更高。

圖3 隨機森林模型和投票模型在訓練集和測試集中的分類效果

4.尿液診斷標志物的MRM驗證

研究者接下來將聯合應用的七個尿液蛋白通過多重反應監測（MRM）方法，在一組由20個高危人群和20個HCC尿液樣本組成的新驗證集中，進行靶向定量驗證。這七個標志物在高危人群和HCC中的相對含量與非靶向蛋白質組學分析中蛋白的表達趨勢是一致的，并且通過ROC分析發現，這七個蛋白通過投票模型聯合應用時，AUC可達0.95，靈敏度和特異度分別為90%和85%。

圖4 MRM驗證集中投票模型的分類效果

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