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    「青蓮客戶文章」一起“鑒”證我們的“朊”實力!

    2020-12-31 00:00:00
    「青蓮客戶文章」一起“鑒”證我們的“朊”實力!
    詳細介紹:

    好消息,青蓮客戶又喜提高分文章啦! 近日,Medicinal Chemistry雜志收錄了中國醫學科學院&北京協和醫學院藥物研究所宋丹青導師和汪燕翔導師合作的題為“Berberine Directly Targets the NEK7 Protein to Block the NEK7?NLRP3 Interaction and Exert Anti-inflammatory Activity”的研究論文。該項研究首次證明NEK7是BBR治療炎癥相關疾病(如2型糖尿病、動脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝和神經退行性疾病)的主要直接靶點之一。在這次發現過程中,小青展示出了相當“硬核”的朊實力呦,擔任了文章中LC-MS/MS檢測工作。我們一起來看看吧!

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    研究思路


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    結果速遞

    1.評估BBR對IL-1β分泌的抑制作用

    建立LPS(含有Nigericin)處理PMA-THP-1(人單核細胞系-1)細胞促進其分泌IL-1β模型。通過Western印跡和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)分析了上清液和裂解液中BBR對Caspase-1裂解和IL-1β分泌的時間和劑量依賴性抑制作用(圖1:a/b/c/d),結果顯示:BBR對IL-1β的分泌表現出中度抑制作用(在BMDM中),IC50值為5.1μM(圖1:e),并且在濃度高達40 μM時,未觀察到細胞死亡或凋亡(圖1f-h),表明BBR的抑制作用與細胞毒性無關。

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    圖1  BBR對PMA-THP-1X細胞中IL-1β分泌的抑制作用




    2.直接靶蛋白的篩選與鑒定

    文章選用了Compound-8d和Compound-15d分別作為陽性/陰性探針,進行蛋白質組靶向篩選,驗證BBR對IL-1β的作用。通過LC-MS/MS分析鑒定的得到了75個蛋白質,其中有10個是酶,其余的是核糖體蛋白、剪接體、微管蛋白等。與15d處理相比,8d處理在25-37 kDa之間檢測到一條明顯的條帶(圖2:c),通過鏈霉親和素珠富集和免疫印跡實驗進一步證實分化條帶為NEK7蛋白(圖2:g)。并且驗證了8d與重組蛋白NEK7的特異性結合,也發現NEK7也能被BBR競爭性抑制(圖2:f/h)。如圖2J所示,BBR對NEK7激酶有中度抑制作用,IC50值為4.2μM,與先前對IL-1β釋放的IC50結果一致。在SPR分析中,BBR還與固定化的NEK7呈現劑量依賴性結合,Kd值為15.6μM(圖2:k)。

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    圖2  蛋白質靶向BBR標記




    3.NEK7與?NLRP3相互作用中的BBR機制

    通過免疫共沉淀(Co-IP)實驗檢測了BBR對NEK7和NLRP3之間相互作用的影響。NEK7的R121殘基正好位于NEK7和NLRP3之間相互作用的關鍵區域之一,如圖3:a所示,在293細胞中,BBR劑量依賴性地抑制了NEK7-NLRP3的相互作用,這在PMA-THP-1細胞中通過內源性Co-IP分析進一步顯示(圖3:b)。相反,沒有亞甲二氧基的O-BBR不能阻斷NEK7-NLRP3的相互作用(圖3:c),BBR未能抑制它們之間的相互作用,而在293細胞中,121-精氨酸被突變為丙氨酸(圖3:d)。R121-A的單點突變可以極大地限制了NEK7與NLRP3之間的相互作用,從而抑制NLRP3炎癥小體的活化以及隨后一系列包括IL-1β在內的炎癥因子的釋放。

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    圖3  BBR阻斷NEK7和NLRP3的相互作用




    4.BBR抑制NEK7的體內驗證

    為了驗證NEK7作為體內BBR對抗炎癥的靶標,作者建立了NEK7敲除小鼠模型以評估BBR對IL-1β產生的影響。試驗通過用腺病毒AdV轉染小鼠10d后,每隔12h給予BBR治療3次,然后LPS刺激。結果發現,小鼠經靜脈內注射Adv shNEK7感染10天后,與對照組相比,NEK7的表達明顯降低(圖4:b);BBR明顯減少了對照組的IL-1β產生(圖4:c),而NEK7基因未見明顯變化。用BBR治療的基因敲除組,表明BBR對IL-1β的NEK7依賴性作用。這些結果表明,由于NEK7抑制與其他機制協同作用,BBR發揮了體內作用。

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    圖4   BBR在體內通過NEK7抑制IL-1β





    結論


    本文基于ABPP的化學蛋白質組學策略,首先確定了NEK7是BBR抗炎的一個重要的直接蛋白質組學靶點,并闡明了BBR通過與NEK7上關鍵的R121殘基的氫鍵特異性地阻斷NEK7?NLRP3的相互作用來發揮其抗炎作用,正是這種非共價鍵使得BBR只表現出適度的抗IL-1β激活的效力,從而緩和了抗炎活性。這一結果有助于以NEK7為靶標實現新型NEK7–NLRP3相互作用抑制劑的開發。



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    小檗堿直接靶向NEK7蛋白阻斷NEK7?與NLRP3的相互作用并發揮抗炎作用

    期刊名稱:Journal of Medicinal Chemistry

    IF:6.205

    樣本選擇:無特定病原體的C57BL/6J的小鼠骨髓來源的巨噬細胞(BMDM)、HEK-293T和L929細胞、THP-1細胞

    取樣策略:探針標記、Pierce Streptavidin磁珠純化

    技術策略:WB、ELISA、PCR、Co-IP、LC/MS



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