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    [蛋白質組學文獻速遞1]乳腺癌細胞的熱蛋白質組分析揭示了CDK4 / 6抑制劑palbociclib的蛋白酶體活化特性

    2020-11-03 00:00:00
    [蛋白質組學文獻速遞1]乳腺癌細胞的熱蛋白質組分析揭示了CDK4 / 6抑制劑palbociclib的蛋白酶體活化特性
    詳細介紹:

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    影響因子:IF=10.557
    發表期刊:The EMBO Journal
    發表時間:2018

          

     乳腺癌占女性癌癥發病首位,全球每年有近200萬例乳腺癌患者,其中雌激素受體陽性(ER +)乳腺癌患者占比75%。使用動物模型和人乳腺癌標本分析證明的在乳腺組織中,CDK4 /cyclin D1對于癌癥的發生至關重要, CDK4 / 6抑制劑具有治療ER+ 乳腺癌的潛力。Palbociclib(帕布昔利布),Abemaciclib(?,斘髂幔┖蚏ibociclib是目前三種針對CDK4 / 6的特異性抑制劑,這些藥物的毒性低,可廣泛用于治療各種腫瘤,在乳腺癌中應用最廣泛。CDK4 / 6抑制劑既可單獨使用,也可以與其他藥物一起聯用,其臨床潛力巨大。自CDK4 / 6抑制劑與激素受體拮抗劑來曲唑的聯合使用在乳腺癌中取得顯著成功后,近來更多其他組合已進入多種疾病的臨床試驗,許多早期臨床試驗的結果顯示CDK4 / 6抑制劑可以增強其他信號通路靶點抑制劑的效力。然而,后來一些研究發現還存在其他機制,CDK4 / 6抑制劑不僅僅使細胞周期停滯,還可以導致細胞衰老,改變細胞的代謝,影響T細胞擴增和免疫系統的功能。
          Miettinen等人(EMBO J,2018)使用了一種熱蛋白質組分析方法發現了一個Palbociclib誘導的衰老機制。Palbociclib通過降低其與蛋白酶體抑制劑ECM29的結合來激活蛋白酶體,引起衰老反應。蛋白酶體活化是Palbociclib誘導的細胞衰老所必需的。

    研究思路

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    結果速遞

    1. MCF7細胞系的熱蛋白質組分析

    MCF7細胞系是ER+、HER2-的乳腺癌細胞系,對palbociclib敏感。MCF7細胞系分別用10um的palboliclib和水處理1h后,均分為10份,分別37---65℃溫度范圍中處理3min(圖1A;左,中),將熱聚集的蛋白去掉,可溶性的蛋白(樣品中加入了32種熱穩定蛋白做內參用于標準化)進行基于質譜的蛋白質組學分析(10標TMT)。結果共鑒定到5515個蛋白,其中3707個蛋白能夠獲得高質量的熱變性曲線。MCF7蛋白質組熱變性曲線的全局分析,49℃是蛋白變性的“災難點”(圖1A;右),這與這與嗜溫菌的“熱死亡點”以及紅白血病細胞系K562的蛋白組熱穩定是一致的。 

    作者為了研究palbociclib對蛋白熱穩定的影響,聚焦到了定量的195個激酶蛋白。在palbociclib與水不同處理對比下,主要的靶標蛋白CDK4與CDK6與預期一樣,熱穩定性是增加了的(圖1.B,C)。CDK4具有所有激酶中第二強的δTm,僅次于磷酸果糖激酶,CDK6 的δTm位列第八位,mTOR也表現出很高的δTm Value(圖1.D)。雖然數據表明palbociclib可能影響多種途徑,包括PI3K / AKT / mTOR信號通路,但PI3K / AKT / mTOR通路抑制作用較弱且僅在較高的藥物濃度下才明顯。

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    圖1.用palbociclib處理的MCF7乳腺癌細胞的熱蛋白質組圖譜。

     

    2. Palbociclib能激活26S蛋白酶體,誘導多聚泛蛋白鏈降解而不激活整個泛素- 蛋白酶體途徑
           

    為分析palbociclib對蛋白質復合物的影響,作者繪制可視化的蛋白復合物δTm和δS,發現Palbociclib影響的蛋白復合體涉及到涉及DNA復制(RAD17-RFC和PCNA-CHL12-RFC2-5復合物)和染色質修飾(E2F-6復合物,STAGA和HMGB1-2復合物;圖2,A)。 此外,還鑒定了mTORC2復合物和20S蛋白酶體。 由于蛋白酶體活性對于細胞周期的有序進展至關重要,并且由于蛋白酶體受mTOR信號傳導調節,并且是人類癌癥中的有效藥物靶標,作者決定決定更詳細地研究蛋白酶體。 完整的26S蛋白酶體由催化核心顆粒20S蛋白酶體和調節顆粒的19S組成。 出乎意料的是,20S蛋白酶體中的所有組分在palbociclib處理時顯示出δTm的增加,而19S亞基在很大程度上不受影響(圖2,B)。
             蛋白酶活性的探針、泛素G76V-GFP生物傳感器檢測了酶活性,發現palbociclib 可以激活多肽底物降解,并且這個降解過程可被蛋白酶抑制劑MG132所抑制。通過Western Blot分析了細胞內泛素化的整體水平,表明1lM palbociclib處理降低了MCF7細胞中泛素綴合蛋白的總體水平(圖2,G和H),而沒有改變20S蛋白酶體水平(圖2,G)

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    圖2.激活蛋白酶體蛋白質降解。

          

     靶向平行反應監測(PRM)質譜分析富集總多聚泛素,該分析證實,在palbociclib處理后,K48、K6、K29和K63鏈的數量顯著減少,這種減少依賴于蛋白酶體活性(圖3),如果palbociclib激活整個泛素 - 蛋白酶體途徑,當蛋白酶體抑制劑阻斷泛素分解時,palbociclib治療應該增加泛素蛋白鏈的水平,然而,事實并非如此,當用palbociclib和硼替佐米共同處理細胞時,沒有泛素鏈類型顯示出增加現象(圖3)。 當用蛋白酶體抑制劑MG-132進行實驗時,得到了類似的結論, 總之,這些數據顯示palbociclib不會引起蛋白質泛素化的增加,因此,palbociclib誘導的蛋白質降解是由于蛋白酶體的特異性激活。

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    圖3. Palbociclib在很大程度上獨立于遍在蛋白系統而激活蛋白酶體。 用1μMpalbociclib和100nM硼替佐米處理MCF7細胞10小時,并通過靶向PRM質譜法定量泛素蛋白復合體。 


    3.Palbociclib通過間接的ECM29介導的機制激活蛋白酶體

    體外蛋白酶體活性測定表明增加的蛋白酶體活性不是由于直接的palbociclib對20S蛋白酶體的影響(圖4)。用palbociclib或mTOR抑制劑Torin-1處理4小時后用 anti-a4 20S亞基抗體免疫沉淀蛋白酶體,并使用定量質譜法比較蛋白酶體蛋白水平的變化和蛋白酶體的磷酸化位點的改變(圖4,D), palbociclib 與Torin-1處理后的發生改變的磷酸化位點Non-overlapping,揭示二者應為完全不同的兩條通路。
           那palbociclib是否可以通過蛋白質水平介導其對蛋白酶體的影響?Palbociclib誘導的蛋白質水平變化遠大于Torin-1誘導的變化(圖4,E),有可能是改變蛋白酶體的結構或者組裝。同時,作者觀察到19s亞基在Palbociclib存在的時時下調的,PSME3(蛋白酶體激活復合物亞基3),ECM29(蛋白酶體支架蛋白)具有Palbociclib誘導的下調的特性(圖4,E)。ECM29,是一個204KDa的蛋白,在酵母中被證實具有抑制蛋白酶體活性的功能,與20S蛋白酶體的結合可改變蛋白酶體構象(De La Mota-Peynado等,2013),這可能解釋了ECM29從蛋白酶體解離后20S熱穩定性的增加。siRNA介導的ECM29沉默增加了MCF7和HeLa細胞中的蛋白酶體活性(圖5,A)。ECM29敲低后,palbociclib處理細胞,并不會像蛋白酶體活性探針Me4BodipyFL-Ahx3Leu3VS和UbG76V-GFP降解實驗中那樣促進蛋白酶體活性(圖5,A)。因此,ECM29 是palbociclib誘導的蛋白酶體活性所必需的,表明ECM29介導palbociclib誘導的蛋白酶體效應。

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    圖4. Palbociclib間接激活蛋白酶體并減少ECM29與蛋白酶體的結合。


    4.ECM29對正常細胞增殖至關重要,其表達可預測乳腺癌中的無復發存活

    CRISPR/Cas9基因編輯的方法敲低了MCF7細胞中的ECM29 的表達,建立一個雜合敲除ECM29 的細胞系,該細胞系表現出增殖緩慢的表型,ECM29敲除細胞也大得多,并且許多細胞對酸性β-半乳糖苷酶活性染色呈陽性,這是細胞衰老的確定標記(圖5,D)。另外其他兩個衰老相關標記,組蛋白H2A.X(cH2AX)S139磷酸化和p21蛋白水平,在siRNA沉默ECM29的MCF7細胞中均是上調的(圖5,E、F、 G ,)。這表明ECM29或相關的蛋白酶體活性可能參與細胞衰老的調節,這使得EMC29成為palbociclib誘導蛋白酶體激活的可能介質。
          作者通過關于無復發乳腺癌患者存活的公開可用基因表達數據檢查了ECM29的潛在乳腺癌關聯(Gyorffy等,2010),數據表明ECM29的表達應作為潛在的生物標志物進行研究,以更好地鑒定那些單獨使用palbociclib或與內分泌治療相結合的個體(圖5)。

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    圖5. ECM29介導palbociclib誘導的蛋白酶體激活,可作為palbociclib治療乳腺癌療效的推定生物標志物。

    5.palbociclib誘導的細胞表型需要蛋白酶體活性

    為了為了獲得蛋白酶體活性增加可限制乳腺癌細胞的生長的完整視圖,作者通過WB 實驗檢測了Palbociclib誘導的MCF7細胞系內源性蛋白降解情況,數據表明Palbociclib除直接抑制CDK4 / 6激酶活性外,長期使用palbociclib還可以通過蛋白酶體依賴性的CDK4降解產生的正反饋抑制細胞增殖。使用palbociclib和硼替佐米分別或共同處理分選出MCF7和T47D細胞系G1期細胞,硼替佐米可抵消palbociclib對蛋白酶體的激活,可以超越palbociclib誘導的兩種細胞系G1期阻(圖6),因此說明蛋白酶體活性的增加對palbociclib誘導的細胞周期的阻滯是必要的。作者還檢測了組蛋白H2A.X(cH2AX)Ser139磷酸化的水平,其是細胞衰老和DNA損傷的標志物(圖7,A和D),表明palbociclib可能在DNA損傷積累和/或修復中起作用??偠灾?,這些結果表明,palbociclib對蛋白酶體的激活對于誘導衰老樣狀態至關重要,palbociclib對蛋白酶體的激活是藥物作用模式的一部分。

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    圖6.高蛋白酶體活性參與palbociclib誘導的G1期阻滯。


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    圖7.蛋白酶體抑制抑制palbociclib誘導的衰老表型。


    總結

    Palbociclib是一種CDK4 / 6抑制劑,被批準用于轉移性雌激素受體陽性乳腺癌。除了導致G1細胞周期停滯,palbociclib治療還會導致細胞衰老,這是一種不易被抑制CDK4 / 6解釋的表型。為了鑒定palbociclib誘導衰老的分子機制,作者對MCF7乳腺癌細胞進行了熱蛋白質組分析。除了影響已知的CDK4 / 6靶標外,palbociclib還能誘導20S蛋白酶體的熱穩定作用,盡管它不直接與之結合。進一步研究表明,palbociclib治療獨立于泛素蛋白途徑(PRM靶向相對定量分析泛素結合蛋白)增加蛋白酶體活性,導致細胞衰老,但可被蛋白酶體抑制劑抵消)。Palbociclib誘導的蛋白酶體活化和衰老由ECM29的蛋白酶體結合減少介導,ECM29的缺失激活蛋白酶體,阻斷細胞增殖,并誘導衰老表型。最后,還發現ECM29 mRNA水平可預測內分泌治療乳腺癌患者的無復發生存率??傊?,熱蛋白質組分析鑒定蛋白酶體和ECM29蛋白作為乳腺癌細胞中palbociclib活性的介質。


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