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    我們就是Nature文章的幕后參與者

    2020-11-03 00:00:00
    我們就是Nature文章的幕后參與者
    詳細介紹:

    在動植物體內病原相關分子模式(PAMP)可以激活先天性免疫。鈣在植物中一直被認為是一個重要的信號,用來誘導PAMP免疫。但是PAMP誘導鈣信號的傳導機制仍舊不清楚。

    2019年7月17日加州大學伯克利分校欒升課題組和首都師范大學李樂攻團隊在Nature雜志上發表了題為“A calmodulin-gated calcium channel links pathogen patterns to plant immunity”的研究性論文,青蓮百奧完成了BIK1磷酸化CNGC4-CT特定位點的質譜鑒定工作。該論文研究發現在植物中當鈣的供給充足時,編碼環核苷酸門控通道(CNGC)蛋白CNGC2和CNGC4可以組裝成一個功能性的鈣通道。在靜息狀態時鈣通道被鈣調蛋白封閉,當病原體入侵時這個通道可以被效應激酶BIK1磷酸化而被激活,從而引起胞漿鈣濃度升高。該研究揭示了CNGC介導的鈣流入是PAMP引發PTI免疫的中間橋梁。


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    文章中作者詳盡闡明了CaM門控的CNGC2-CNGC4通道作用機理模式圖。在病原體出現之前,PRR是處于失活狀態,CNGC2-CNGC4 Ca2+通道是關閉的,這一過程是以CaM依賴的方式來維持靜息Ca2+的水平;當病原體出現后,PAMP就會和PRRs結合,PRRs進一步使BIK1磷酸化而活化,接著BIK1可以使RBOHD磷酸化,RBOHD的磷酸化促進了ROS的產生?;罨腂IK1也可以直接活化CaM門控的CNGC2-CNGC4通道復合體,引起Ca2+的流入。產生的ROS能被感應器感知,使CaM門控的CNGC2-CNGC4通道更進一步活化,引起Ca2+的持久流入。因此,CaM門控的CNGC2-CNGC4通道介導的Ca2+流入和ROS的產生形成了一個正反饋環路,傳遞防御信號并提高免疫輸出。
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    鈣離子調控植物免疫的重要性雖然已經被研究了很久,但分子機制的研究一直沒有被揭示。本研究將PAMP誘導鈣信號的傳導機制,分子作用靶點詳盡闡明。例如文章中BIK1磷酸化CaM門控的CNGC2-CNGC4通道復合物,Ca2+要流入必須要得到CNGC2-CNGC4通道的允許,同時CaM門也要開啟。這就好比你去找導師匯報工作,要提前預約好時間,得到導師的同意后你才能去找,到了辦公室門口你發現門還是關著的,你不能直接破門而入。首先,你要敲門,再進去;你敲門的方式還有講究,不能太重,也不能太輕,太重顯得粗魯,太輕導師不容易察覺;敲門的位置也要到位,你要在特定的位點去敲門,不能去敲門角,門框。你去找導師匯報工作,這看似很簡單的事情卻也這么復雜。Ca2+要流入胞漿這一很簡單的生理過程也是經過了復雜的調控??蒲芯褪菍⑦@一看似簡單卻又復雜的過程闡明。

    文章中作者詳細介紹了Ca2+流入胞漿時通過CaM門控的CNGC2-CNGC4通道的分子機理,其中關鍵的一步就是BIK1磷酸化CNGC4-CT的特定位點。這么關鍵的一塊作者是怎么設計實驗的呢?青蓮百奧幫你來解答。文中作者用200ng的GST-BIK1和2ug TF-CNG4-CT底物,在25ul含有1mM ATP的激酶緩沖液中30℃下共孵育1小時,之后用SDS上樣緩沖液終止反應;反應后的蛋白樣品用SDS-PAGE膠進行分離,再用考馬斯亮藍染色;TF-CNGC4-CT的條帶切膠后用胰酶消化,液相色譜法串聯質譜的技術用于肽段的鑒定,鑒定結果通過比對擬南芥數據庫,其中可變修飾設置成磷酸化(S/Y/T)。下面就來看看本文中我們為作者篩選到的磷酸化位點。
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    那么,這些位點是怎么分析到的呢?接下來就為你們介紹下這個原理吧,知其然而知其所以然這才是做科研要追求的嘛。

    其實,上面位點的確定就是根據質譜的二級圖譜得到的。如果您想知道怎么看二級質譜圖,首先要明白什么是by離子。肽段在能量作用下會生成一個個by離子對,我們實際檢測到的二級離子的質荷比的分布就是二級質譜圖,用實際檢測與理論形成的離子匹配后的圖譜也稱為b,y離子匹配圖。

    就拿文章中第1個二級譜圖舉例吧,左面的為b離子,右邊的為y離子,yHLCLDLVR理論生成的by離子對為:如果是yH中間斷開,則生成b1=y(從左往右數),y8= HLCLDLVR(從右往左數8個)第二個與第三個氨基酸中間斷開,生成b2=yH, y7= LCLDLVR,依次類推……。你的肽段修飾氨基酸是第1個y(已經小寫),一價b1=y,不帶修飾的y理論分子量為181-18(yH連接是脫了水的)=163,我們檢測到的一價y8分子量為968,而總的分子量為1211,那么y的分子量就是1211-968=243,檢測到的分子量比理論值多243-163=80,剛好是磷酸化修飾的分子量,所以b1離子的質荷比說明他是被磷酸化修飾了的。其余肽段氨基酸位點的修飾同理。想通了是不是就覺得很簡單呢?

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