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    凝集素受體樣激酶LORE的酪氨酸磷酸化調節植物免疫力

    2020-10-23 00:00:00
    凝集素受體樣激酶LORE的酪氨酸磷酸化調節植物免疫力
    詳細介紹:

    中國科學院微生物研究所劉俊組羅旭明老師發表了題為“Tyrosine phosphorylation of the lectin receptor-like kinase LORE regulates plant immunity”的文章,揭示了植物識別病原細菌的新機制。通過環環相扣不斷深入的研究最終證明了植物模式識別受體LORE感受病原菌攜帶的中等鏈長度的3-OH-C10:0,進而引起LORE Y600發生磷酸化,從而進一步激活免疫響應;然而病原菌可以分泌另外一種蛋白HopAO1從而抑制植物免疫。本文中的關鍵蛋白LORE及磷酸化修飾位點Y600的鑒定得到了青蓮百奧質譜平臺的傾心助力。下面讓我們一起細細品讀這一研究成果。640.png


    凝集素受體樣激酶LORE的酪氨酸磷酸化調節植物免疫力



    文章思路



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    背景介紹

    在脂質A生物合成過程中釋放的游離mc-3-OH-FA廣泛存在于假單胞菌中。此外,mc-3-OH-FAs是一組激活擬南芥植物免疫力的關鍵PAMPs。盡管LORE是mc-3-OH-FAs的關鍵植物免疫受體,但還不知道LORE如何被激活以及下游免疫成分是什么。本文報道了,LORE的酪氨酸殘基(Y600)在暴露于3-OH-C10:0時被磷酸化,酪氨酸磷酸化的LORE隨后反向磷酸化特定的RLCK來轉導免疫信號。此外,本文也證明了細菌酪氨酸磷酸酶HopAO1抑制LORE的酪氨酸磷酸化,抑制3-OH-C10:0激活的免疫反應。本文闡明了擬南芥中LORE介導的免疫事件的潛在機制,為植物免疫途徑提供了新的見解。

    實驗結果

    一、LORE的酪氨酸磷酸化對于3-OH-C10:0激活的免疫反應至關重要

    LORE包含細胞外凝集素結構域、跨膜結構域和激酶結構域。該RD(Arg-Asp)絲氨酸/蘇氨酸(S/T)激酶的K516和D613殘基是對其激酶活性必不可少的保守氨基酸。研究者使用32P標記的三磷酸腺苷(ATP)進行的體外激酶分析表明,LORE是真正的激酶,而K516和D613是兩個激酶活性的基本位點,而重組的LOREK516E和LORED613V突變蛋白未能進行自身磷酸化。

    K252a是一種兼具S/T和酪氨酸(Y)激酶活性的非特異性激酶抑制劑,而A23是一種酪氨酸激酶抑制劑。K252a和Mock都強烈抑制3-OH-C10:0觸發的ROS爆發(圖1A)。抑制激酶活性和酪氨酸磷酸化也顯著降低了PTI標記基因FRK1和NHL10的轉錄水平(圖1B),這表明LORE介導的PTI需要激酶活性和酪氨酸磷酸化。
    使用純化的重組GST-LORE-CD蛋白進行的體外激酶測定顯示LORE的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化,即使酪氨酸磷酸化被A23抑制,也表明LORE是一種雙特異性蛋白激酶。A23完全抑制了3-OH-C10:0觸發的ROS爆發的觀察結果(圖1A)。另外使用A23抑制了其酪氨酸的磷酸化,MPK
    3/6磷酸化明顯降低(圖1C)。640 (2).png


    Figure 1. The kinase activity of LORE is essential for 3-OH-C10:0 sensing.



    二、3-OH-C10:0誘導LORE Tyr600磷酸化

    使用體外激酶測定及液相色譜-串聯質譜分析(LC-MS/MS),確定Y600為LORE的磷酸化位點(圖2A)。Y600是擬南芥和水稻中G型凝集素激酶中一個保守的酪氨酸位點。體外激酶測定表明,用苯丙氨酸(LOREY600F)取代Y600明顯降低了LORE的激酶活性(圖2B)。


    盡管在這些植物中LORE Y600在基礎水平上被磷酸化,但是3-OH-C10:0進一步促進了Y600的磷酸化(圖2D)。值得注意的是,磷酸化水平在15分鐘后下降(圖2D),表明植物磷酸酶參與了酪氨酸磷酸化的調節。


    三、LORE介導的3-OH-C10:0識別需要LORE Y600磷酸化

    3-OH-C10:0特異性地誘導LORE的Y600磷酸化,那么Y600磷酸化是否有助于LORE介導的3-OH-C10:0的識別。進而研究了具有LORE啟動子驅動的LORE,LOREY600F或激酶失活的LOREK516E的突變植株。顯示出對3-OH-C10:0的響應而顯著破壞了ROS爆發(圖2E)。用野生型LORE進行的轉化完全補充了突變體的異常表型,而激酶失活的突變體LOREK516E沒有(圖2E)。與pLORE:LOREK516E相似,pLORE:LOREY600F互補系表現出顯著降低的ROS水平。


    研究者進而使用RT-qPCR檢測了3-OH-C10:0處理后擬南芥葉片中PTI應答基因FRK1和NHL10的轉錄水平。實際上,這些基因在pLORE:LORE Y600F互補系中對3-OH-C10:0幾乎沒有反應。就生長抑制而言,pLORE:LOREY600F互補系對3-OH-C10:0的敏感性與突變體一樣,與Columbia-0(Col-0)和LORE互補相比,它們的根系更長(圖2F)。

    細菌生長曲線分析表明,Y600對于LORE介導的疾病抵抗至關重要。與pLORE:LOREK516E植物相似,pLORE:LOREY600F互補植物與Col-0和LORE互補植物相比,表現出更高的疾病易感性(圖2G)。與其他PAMP一樣,用3-OH-C10:0進行預處理可以增強植物的抗病性。因此,檢測了是否需要Y600來啟動防御反應。用3-OH-C10:0進行預處理可提高LORE互補系的抗病性,但不會增強pLORE:LOREY600F互補系的抗病性。這些結果表明LORE Y600的磷酸化參與3-OH-C10:0感知下游的信號傳導。


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    Figure 2. Y600 is a key phosphorylation site of LORE.



    四、LORE與PBL34及其兩個類似物相關

    基于預測定位于質膜或RLCKs的蛋白質,因為RLCKs可以轉導植物中PRR介導的免疫信號。在鑒定出的與LORE相互作用的蛋白質中,PBL34(AT5G15080)符合標準。


    酵母雙雜交證實PBL34與LORE-CD相互作用(圖3A)。PBL35和PBL36都與酵母中的LORE相互作用,但PBL39沒有,這表明LORE與特定的PBL相互作用(圖3A)。使用重組PBL蛋白,結果顯示MBP-PBLs成功拉下了LORE-CD,但MBP不能成功(圖3B)。此外,通過抗FLAG co-IP和分裂熒光素酶測定,顯示了PBL與植物中的全長LORE相互作用(圖3C和D)。通過根癌農桿菌介導的轉化在本氏煙草葉片中瞬時表達PBL34/35/36-GFP,證明了PBL34/35/36定位于質膜。此外,在本氏煙草中通過BiFC實驗證實了與質膜上的PBL相互作用。這些結果表明,PBL34/35/36是參與擬南芥中LORE介導的免疫反應的LORE復合物的成分。

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    Figure 3. PBLs interact with LORE in vitro and in vivo.



    五、pbl34/35/36突變體顯示出對3-OH-C10:0的反應降低
    通過用3-OH-C10:0和Pst DC3000處理PBL34/35/36,其中PBL34的表達水平高于PBL35和PBL36,如RT-qPCR所示。然后,檢測了pbl34、35、36單突變體,pbl34/35雙突變體和pbl34/35/36三突變體對3-OH-C10:0的PTI反應。ROS爆發分析表明pbl34、35、36單突變體對3-OH-C10:0的響應與Col-0相似,而pbl34/35雙突變體則顯示出稍微降低的響應,而pbl34/35/36三聯突變體顯示ROS爆發明顯減少(圖4A)。在pbl34/35/36三突變體中檢查了另外兩個PTI反應,即FRK1和NHL10轉錄和胼胝質沉積。如圖4B所示,在pbl34/35/36三重突變體中,響應于3-OH-C10:0的FRK1和NHL10的上調顯著降低(圖4B)。同樣,pbl34/35/36三重突變體積累的胼胝質比Col-0少(圖4C)。

    用3-OH-C10:0處理可強烈抑制Col-0中的根部生長,但不抑制LORE或pbl34/35/36中的根生長(圖4D)。細菌生長曲線分析支持了pbl34/35/36三重突變體表現出PTI受損,因為與Col-0相比,三重突變體中細菌滴度顯著更高,而pbl34/35雙重突變體中細菌滴度卻更高。然而,Pol34在Col-0中的過表達顯著增強了抗病性(圖4E)。這些結果表明PBL34/35/36參與了對3-OH-C10:0的響應,并且在功能上是冗余的。

    通過啟動子驅動的PBL34補充了pbl34/35/36三重突變,從而將抗病性表型完全恢復為野生型水平(圖4F)。此外,互補系顯示出完全恢復的ROS爆發。與3-OH-C10:0相比,在pbl34/35/36突變體flg22中,ROS爆發的誘導大大降低,而與各自的Col-0對照相比,突變體中幾丁質誘導的ROS爆發僅在突變體中受到了損害。但是,在bik1/pbl1突變體中,3-OH-C10:0誘導的PTI反應略有降低。以上結果進一步表明,三個PBL在LORE介導的免疫信號傳導中在功能上是冗余的,并且特異性應答3-OH-C10:0而不是其他PAMP。



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    Figure 4. PBL triple mutants exhibited compromised PTI triggered by 3-OH-C10:0.




    六、LORE磷酸化PBL34

    LORE是與PBL34相互作用的真正激酶(圖3)。GST-LORE-CD經歷了自動磷酸化并直接磷酸化MBP-PBL34,而激酶失活的突變蛋白GST-LOREK516E則不會(圖5A)。通過LC-MS/MS檢測PBL34的磷酸化位點顯示T306/T310被LORE-CD磷酸化。T306和T310位于許多RLCK VII亞家族激酶的保守激活環路中,表明LORE介導的T306/T310的磷酸化激活了PBL34的激酶活性。


    通過將這兩個位點突變為丙氨酸(PBL34T306A/T310A,此后稱為PBL34-2A)。在體外激酶測定中,該突變大大減弱了MBP-PBL34的放射性信號(圖5B),表明T306和T310是PBL34中被LORE磷酸化的兩個主要位點。而且,LOREY600F不能像野生型LORE一樣有效地磷酸化MBP-PBL34(圖5C),表明PBL34的磷酸化取決于LORE的Y600磷酸化。

    由于LORE在體外會磷酸化PBL34的激活環路,研究者在擬南芥原生質體中表達了PBL34和PBL34-2A,然后用3-OH-C10:0處理原生質體。3-OH-C10:0處理使PBL34的磷酸化增加,但PBL34-2A的磷酸化卻沒有(圖5D),表明T306/310響應3-OH-C10:0進行了磷酸化。這些結果表明PBL34的磷酸化在遺傳上取決于LORE,并且3-OH-C10:0通過LORE促進這種磷酸化。PBL34從LORE的3-OH-C10:0觸發解離依賴于PBL34激酶活性,因為PBL34K180E的激酶失活突變體未從LORE解離(圖5G)。除PBL34外,LORE也將PBL35和PBL36磷酸化。這些結果表明LORE與PBL34或其PBL35和PBL36旁系同源物形成復合物,但是該復合物在3-OH-C10:0存在下可以解離。


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    Figure 5. LORE phosphorylates PBL34 at T306/T310 for immune responses.



    七、PBL34的T306/T310磷酸化對于LORE介導的3-OH-C10:0識別的重要性

    在ROS爆發測定中,pbl34/35/36三重突變體顯示出對3-OH-C10:0的應答減少;然而,當轉化為pbl34/35/36三重突變體時,PBL34而非PBL34-2A挽救了ROS爆發(圖5H)。值得注意的是,與LORE或LORE(Y600F)相比,pbl34/35/36和PBL34-2A對3-OH-C10:0處理的響應仍然較弱(圖5H)。


    通過RT–qPCR檢測了FRK1和NHL10的轉錄水平,并證明了用PBL34-2A進行的轉化未能挽救pbl34/35/36植物中響應3-OH-C10:0的這些轉錄水平的降低(圖5I)。此外,PBL34擬磷酸酶CM-PBL34-2D品系響應3-OH-C10:0表現出增強的ROS爆發。這些發現表明LORE對PBL34 T306/T310的磷酸化是3-OH-C10:0觸發的免疫應答是必不可少的。


    八、細菌酪氨酸磷酸酶HopAO1靶向LORE

    假單胞菌分泌的效應物HopAO1是一種靶向EFR的磷酸酶,可在感知EF-Tu的過程中逆轉酪氨酸磷酸化,從而導致抑制PTI。本文證明了HopAO1與LORE-CD相互作用,正如MBP和GST-Pulldown實驗所揭示(圖6A)。使用本氏煙草中瞬時表達的蛋白質進行的Co-IP分析證實了這種相互作用。如圖6B所示,HopAO1-FLAG與LORE-T7相互作用,而GFP-FLAG不相互作用。


    另外HopAO1幾乎完全抑制了擬南芥或本氏煙草葉中LORE介導的ROS爆發(圖6E和C)。相比之下,功能缺陷的HopAO1CS不能抑制該ROS爆發。這些結果顯示,HopAO1通過使酪氨酸磷酸化的Y600去磷酸化來抑制ROS爆發。與之一致的是,在雌二醇誘導后,使用3-OH-C10:0預處理過表達雌二醇誘導型啟動子驅動的HopAO1的轉基因擬南芥植株對Pst DC3000的抗性顯著降低(圖6F)。這些結果表明,HopAO1靶向LORE,特別是酪氨酸磷酸化的Y600去磷酸化,因此抑制了PTI。
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    Figure 6. Pst effector HopAO1 targets LORE for tyrosine dephosphorylation.

    結論

    植物模式識別受體LORE感受病原菌攜帶的中等鏈長度的3-OH-C10:0,進而引起LORE Y600發生磷酸化;磷酸化的LORE進一步轉移磷酸化胞內受體類激酶,從而進一步激活免疫響應。但是,病菌可以分泌蛋白HopAO1去除LORE Y600的磷酸化,抑制免疫反應。


    參考文獻

    Luo Xuming,Wu Wei,Liang Yingbo,Xu Ning,Wang Zongyi,Zou Huasong,Liu Jun. Tyrosine phosphorylation of the lectin receptor-like kinase LORE regulates plant immunity.[J]. The EMBO journal,2020,39(4).


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